詳細分析杜恩斯勻漿器的操作步驟流程
更新時間：2019-11-20 點擊次數：2290次
杜恩斯勻漿器的電源是兩個AA干電池，可直接用在離心管里勻漿，配上不同的槌和管便可實現從0.5ml至50ml的組織勻漿；勻漿快速，便用輕便，操作簡單，無需特別維護。提供無菌包裝，無DNA酶和RNA酶，無致熱源的一次性使用槌；也有可反復使用的聚丙烯（PP）材料槌和不銹鋼（SS）槌。
1、獲得目的基因：
a、通過PCR方法：以含目的基因的克隆質粒為模板，按基因序列設計一對引物，PCR循環獲得所需基因片段。
b、通過RT-PCR方法：用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉錄形成cDNA第1鏈，以逆轉錄產物為模板進行PCR循環獲得產物。
2、構建重組表達載體：
a、杜恩斯勻漿器載體酶切：將表達質粒用限制性內切酶進行雙酶切，酶切產物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。
b、PCR產物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。
3、獲得含重組表達質粒的表達菌種：
a、將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，根據重組載體的標志作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質粒，雙酶切初步鑒定。
b、測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進入下步操作。否則應篩選更多克隆，重復亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。
c、以此重組質粒DNA轉化表達宿主菌的感受態細胞。
4、誘導表達：
a、杜恩斯勻漿器挑取含重組質粒的菌體單斑至2mlLB（含Amp50μg/ml）中37℃過夜培養。
b、按1∶50比例稀釋過夜菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養基的300ml培養瓶中,37℃震蕩培養至OD600≌0.4-1.0（*0.6，大約需3hr）。
c、取部分液體作為未誘導的對照組,余下的加入IPTG誘導劑至終濃度0.4mM作為實驗組,兩組繼續37℃震蕩培養3hr。
d、分別取菌體1ml,離心12000g×30s收獲沉淀，用100μl1%SDS重懸，混勻,70℃10min。
e、離心12000g×1min，取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。
咨詢電話